Chapitre 9 : Techniques de Laboratoire en Microbiologie
Introduction
Ce chapitre traite des techniques de laboratoire essentielles en microbiologie. Il couvre les méthodes de stérilisation et d'asepsie, les techniques de coloration et d'identification des micro-organismes, ainsi que les tests biochimiques et moléculaires. Ces techniques sont fondamentales pour les microbiologistes car elles permettent d'identifier, de manipuler et d'étudier les micro-organismes de manière sûre et efficace.
Section 1 : Techniques de Stérilisation et d'Asepsie
1.1 Stérilisation
La stérilisation est le processus d'élimination ou de destruction de tous les micro-organismes, y compris les spores, sur un objet ou une surface. Plusieurs méthodes de stérilisation sont couramment utilisées en laboratoire :
1- Stérilisation par la chaleur :
- Chaleur humide : Utilisation de la vapeur sous pression dans un autoclave. Température typique : 121°C pendant 15-20 minutes. C'est la méthode la plus efficace pour la stérilisation des milieux de culture, des instruments et des déchets biologiques.
- Chaleur sèche : Utilisation d'un four à chaleur sèche. Température typique : 160-170°C pendant 2-3 heures. Utilisé pour les objets qui peuvent supporter des températures élevées sans se dégrader, comme le verre.
2- Stérilisation par filtration :
- Utilisée pour les liquides sensibles à la chaleur. Les filtres possèdent des pores de 0,2 µm ou moins, qui retiennent les bactéries et autres micro-organismes.
3- Stérilisation chimique :
- Utilisation de produits chimiques comme l'éthylène oxyde, le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde. Ces agents sont souvent utilisés pour stériliser les instruments médicaux et de laboratoire sensibles à la chaleur.
4- Stérilisation par irradiation :
- Utilisation de rayons gamma ou de rayons UV. Les rayons gamma sont efficaces pour la stérilisation des produits pharmaceutiques et des fournitures médicales. Les rayons UV sont principalement utilisés pour stériliser les surfaces et les environnements de laboratoire.
1.2 Asepsie
L'asepsie est l'ensemble des mesures prises pour empêcher la contamination par des micro-organismes. Voici quelques techniques courantes :
1- Techniques de travail stérile :
- Utilisation de becs Bunsen pour créer une zone stérile.
- Désinfection des surfaces de travail avec des désinfectants appropriés.
- Utilisation de gants, de masques et de blouses stériles.
2- Techniques de manipulation des cultures :
- Utilisation de pipettes stériles et de boucles d'inoculation stériles.
- Travail en environnement contrôlé, comme une hotte à flux laminaire.
3- Contrôle de l'environnement :
- Filtration de l'air dans les salles blanches.
- Surveillance régulière de la qualité de l'air et des surfaces pour détecter la présence de contaminants.
Section 2 : Méthodes de Coloration et d'Identification des Micro-Organismes
2.1 Techniques de Coloration
Les techniques de coloration sont essentielles pour observer et identifier les micro-organismes au microscope. Voici quelques méthodes couramment utilisées :
1- Coloration de Gram :
- Permet de différencier les bactéries à Gram positif (violettes) des bactéries à Gram négatif (roses). Elle repose sur la structure de la paroi cellulaire.
- Étapes : fixation de la cellule, application de violet de cristal, ajout d'iode de Lugol, décoloration à l'alcool-acétone, contre-coloration à la fuchsine ou à la safranine.
2- Coloration de Ziehl-Neelsen :
- Utilisée pour identifier les bactéries acido-alcoolo-résistantes, comme Mycobacterium tuberculosis.
- Étapes : application de fuchsine phéniquée, chauffage, décoloration à l'acide-alcool, contre-coloration au bleu de méthylène.
3- Coloration de spore :
- Permet de visualiser les spores bactériennes, souvent résistantes aux conditions extrêmes.
- Étapes : coloration à la malachite verte sous chaleur, décoloration à l'eau, contre-coloration à la safranine.
4- Coloration négative :
- Utilisée pour observer les capsules bactériennes. Les capsules apparaissent comme des halos clairs autour des cellules colorées.
- Utilisation de l'encre de Chine ou de la nigrosine.
2.2 Méthodes d'Identification
L'identification des micro-organismes repose sur plusieurs techniques :
1- Observation microscopique :
- Morphologie cellulaire, arrangement des cellules, présence de structures spécifiques comme les spores ou les flagelles.
2- Culture et isolement :
- Utilisation de milieux de culture sélectifs et différentiels pour isoler et identifier les micro-organismes.
3- Tests biochimiques :
- Identification basée sur les caractéristiques métaboliques et enzymatiques des micro-organismes. Voir Section 3 pour plus de détails.
Section 3 : Tests Biochimiques et Moléculaires
3.1 Tests Biochimiques
Les tests biochimiques sont utilisés pour identifier les micro-organismes en fonction de leurs propriétés métaboliques. Voici quelques tests courants :
1- Test de la catalase :
- Détecte la présence de l'enzyme catalase, qui décompose le peroxyde d'hydrogène en eau et oxygène. Les bactéries catalase-positives produisent des bulles en présence de peroxyde d'hydrogène.
2- Test de l'oxydase :
- Détecte la présence de cytochrome c oxydase, impliquée dans la chaîne de transport des électrons. Un changement de couleur indique un résultat positif.
3- Test de la fermentation des glucides :
- Détermine la capacité des bactéries à fermenter différents glucides, produisant des acides ou des gaz. Utilisation d'indicateurs de pH pour détecter les produits de fermentation.
4- Test de l'uréase :
- Détecte la présence de l'enzyme uréase, qui hydrolyse l'urée en ammoniac et dioxyde de carbone. Un changement de couleur indique un résultat positif.
5- Test de la mobilité :
- Détermine si les bactéries sont mobiles en utilisant un milieu semi-solide. La diffusion des bactéries depuis le point d'inoculation indique la mobilité.
3.2 Tests Moléculaires
Les techniques moléculaires permettent une identification plus précise et rapide des micro-organismes. Voici quelques méthodes couramment utilisées :
1- PCR (Polymerase Chain Reaction) :
- Amplifie des segments spécifiques d'ADN pour détecter et identifier les micro-organismes. Utilisée pour les diagnostics rapides et précis.
2- Séquençage de l'ADN :
- Permet de déterminer la séquence nucléotidique d'un segment d'ADN. Utilisé pour l'identification des espèces et l'étude des relations phylogénétiques.
3- Hybridation de l'ADN :
- Utilisation de sondes spécifiques pour détecter des séquences d'ADN cibles. Méthode rapide pour l'identification des micro-organismes.
4- Electrophorèse en gel :
- Séparation des fragments d'ADN en fonction de leur taille. Utilisée pour analyser les produits de PCR et les profils de restriction.
5- Blotting (Southern, Northern, Western) :
- Techniques pour détecter des séquences spécifiques d'ADN (Southern), d'ARN (Northern) ou des protéines (Western).
Conclusion
Les techniques de laboratoire en microbiologie sont essentielles pour l'étude, l'identification et la manipulation des micro-organismes. La maîtrise de ces techniques permet aux microbiologistes de mener des recherches précises et de développer des applications pratiques dans divers domaines, notamment la médecine, l'agriculture et l'industrie.